Die Diagnostik erfolgt mittels eines einfachen Bluttests. Hier wird die Höhe des ACTH-Spiegels bestimmt. ACTH (Adenocorticotropes Hormon) ist ein Hormon, das von der Hirnanhangsdrüse produziert wird und im Endeffekt die Ausschüttung von unter anderem Cortisol in der Nebennierenrinde steuert. Bei Cushing ist der ACTH-Wert abnormal erhöht.

Allerdings kann die Ausschüttung des Hormons auch bei Schmerzen und Stress (z. B. bei einem akuten Hufreheschub, einem Hufabszess, einer Allergie oder auch einfach nur einem gestressten, ängstlichen Pferd bei der Blutentnahme) erhöht sein. Dies muss vom Tierarzt bei der Beurteilung der Ergebnisse mit einbezogen werden.

In der Regel wird daher während einer solchen schmerzhaften Erkrankung kein Blut für einen Cushing-Test abgenommen. Wenn allerdings ein Pferd z. B. ohne erkennbare Ursache an Hufrehe leidet und der Schub nicht in den Griff zu bekommen ist, lohnt es sich in manchen Fällen trotzdem, parallel eine Cushing-Diagnostik einzuleiten. Der Wert muss dann mit Vorsicht interpretiert werden, kann aber einen zusätzlichen Hinweis geben (wenn er niedrig ist, ist zumindest Cushing ausgeschlossen!).

Insgesamt sollte nie der Blutwert isoliert betrachtet werden, sondern immer in Zusammenhang mit dem Pferd selbst und der möglicherweise bestehenden aktuellen Problematik.

Mit einem dynamischen Test (Dexamethason-Suppressions-Test) können unklare Verdachtsfälle weiter eingegrenzt werden. Dabei werden mehrere Blutproben vor und nach Injektion eines Cortison-Präparates untersucht. Aufgrund der Cortison-Injektion ist dieser Test allerdings bei Hufrehe gefährdeten Pferden kritisch zu beurteilen.